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Material und Methoden

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Elektrodenpuffer Puffer pH 7,9

Papierelektroden

•

Formamid Kat. Nr. 1.09684 (Fa. Merck, Darmstadt)

•

PlusOne™ DNA Silver Staining Kit Kat. Nr. 17-6000-30 (Fa. Pharmacia Biotech,

Uppsala/Schweden) beinhaltet

Fixierlösung 5x Benzschwefelsäure 3,0% w/v in 24% Ethanol

Silbernitratlösung 5x Sibernitrat 1,0% w/v

Benzschwefelsäure 0,35% w/v in H

Entwicklerlösung 5x Natriumkarbonat 12,5% w/v in H

Stop-Lösung 5x Essigsäure 5,0% v/v

Natriumazetat 25,0% v/v

Glycerol 50,0% in H

Formaldehyd 37% w/v in H

Natriumthiosulfat 2% w/v in H

2.6.3 Durchführung

Am Anfang der SSCP-Analyse steht die Amplifizierung der DNA mittels PCR

(siehe Kapitel 2.4) und deren Kontrolle mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese

(siehe Kapitel 2.5).

Das trockene Polyacrylamidgel wird im GelPool mit 25 ml Gelpuffer für

mindestens eine Stunde rehydriert. Um eine optimale Verteilung des Puffers zu

erreichen, wird das Gel während dieser Zeit vorsichtig geschüttelt, wobei die

Bildung von Luftblasen unter dem Gel zu vermeiden ist, da es an diesen Stellen

nicht rehydriert und der spätere Lauf deutlich behindert wird. In der

Zwischenzeit werden in je einem Eppendorf-Röhrchen die PCR-Produkte (4

O

mit Formamid im Verhältnis 1:1 zusammenpipettiert. Nach kurzem Schütteln

und Abzentrifugieren wird die DNA bei 95°C 5 Minuten lang denaturiert und

anschließend bis zur Weiterverwendung (mindestens 5 Minuten) auf 4°C

heruntergekühlt.

Das rehydrierte Gel wird mit Filterstreifen getrocknet, wobei darauf zu achten

ist, dass die Matrix dabei nicht beschädigt wird. Die auf die gewünschte

Temperatur gebrachte Kühlplatte der Elektrophoreseeinheit wird mit 70%

Ethanol benetzt und das Gel aufgebracht. Auch hier ist die Bildung von

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