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Material und Methoden

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der Reverse-Primer aus einer DNA-Basensequenz des Reverse-Stranges im

3`-Bereich. Zu Beginn wird ein Reaktionsgemisch angesetzt, welches aus dem

Forward- und dem Reverse-Primer, Reaktionspuffer, Dinukleosidtriphosphaten,

und Taq-Polymerase besteht. Eine definierte Menge dieses

5HDNWLRQVJHPLVFKHV O ZLUG DXI MHZHLOV  O GHU ]X XQWHUVXFKHQGHQ '1$

gegeben.

,QHLQHP*HVDPWYROXPHQYRQOEHILQGHQVLFK

O DNA

O DEPC-Wasser

O Forward-Primer

O Reverse-Primer

O dNTP

O Puffer

O Taq-Polymerase

Zu Beginn der Reaktion wird die DNA initial für 5 Minuten bei 95°C denaturiert

und dabei in ihre Einzelstränge aufgespalten. In der sich anschließenden

Zyklusphase kommt es mit jedem durchlaufenen Zyklus zu einer Verdopplung

der DNA-Menge. Der Zyklus selbst besteht aus drei aufeinander abgestimmten

Teilreaktionen, für die jeweils unterschiedliche Temperaturen erforderlich sind.

Zu Beginn eines jeden Zyklus wird für 45 Sekunden bei 94°C denaturiert. Für

den nächsten Schritt des so genannten Annealing (Hybridisierung der Primer

oder Anheftung) wird bis auf eine für den Primer spezifische Temperatur, die

vorher experimentell ermittelt werden muss und meistens zwischen 50°C und

65°C liegt, abgekühlt. Diese Temperatur wird für weitere 30 Sekunden gehalten

und anschließend für den Schritt der Elongation (DNA-Synthese) für 45

Sekunden auf 72°C angehoben. Während dieser Zeit heftet die Taq-

Polymerase Nukleotide an die 3`-OH-Primer-Enden und es werden somit zwei

komplementäre Stränge synthetisiert. Diese Zyklen werden 30 mal wiederholt.

Die PCR endet mit einem Kettenverlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72°C.

Die PCR-Produkte werden vom Gerät auf 4°C heruntergekühlt und im

Folgenden bis zum weiteren Gebrauch bei 4°C bis –20°C gelagert.

Abweichungen vom oben genannten Schema werden an entsprechender Stelle

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